核酸磷酸酯酶主要作用是催化水解由磷酸作为酸的部分的酯的酯键。两类磷酸酯水解酶即磷酸一酯水解酶和磷酸二酯水解酶的底物分别为磷酸一酯和磷酸二酯。磷酸二酯水解酶催化原磷酸形成的两个酯键中的一个水解，这类酶中最重要的是水解核酸和磷脂中特定的磷酸二酯键的那些酶。